Qramın Boyanma Metodunun 3 Yolu

2024 Müəllif: Jason Gerald | [email protected]. Son dəyişdirildi: 2023-12-16 10:54

Qram boyama sürətli bir üsuldur və bir toxuma nümunəsində bakteriyaların varlığını görmək və hüceyrə divarlarının kimyəvi və fiziki xüsusiyyətlərinə əsaslanaraq bakteriyaları qram-müsbət və ya qram-mənfi olaraq təsnif etmək üçün istifadə olunur. Qram boyası demək olar ki, həmişə bakterial infeksiyanın diaqnozunda ilk addım kimi istifadə olunur.

Bu boyama texnikası, 1882 -ci ildə texnikanı inkişaf etdirən və 1884 -cü ildə oxşar klinik simptomları olan iki növ bakteriyanı ayırmaq üçün bir texnika olaraq nəşr etdirən Danimarkalı alim Hans Christian Gramın (1853 - 1938) adını daşıyır: Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) və bakteriyalar Klebsiella pneumoniae.

Addım

Metod 1: Mikroskop Slaydının Hazırlanması

Addım 1. Laboratoriyada işləməyə hazırlaşın

Test etdiyiniz nümunənin bakterial çirklənməsinin qarşısını almaq üçün əlcəklər və uzun saçlı qalstuk taxın. İş yerini baca altında və ya yaxşı havalandırılan başqa bir yerdə təmizləyin. Bunsen brülörünü yoxlayın və işə başlamazdan əvvəl mikroskopun düzgün işlədiyinə əmin olun.

Addım 2. Mikroskop şüşə slaydını sterilizasiya edin

Şüşə ləkə çirklidirsə, sabunlu su ilə yuyun və yağ və kirdən təmizləyin. Slaydları etanol, şüşə təmizləyici və ya laboratoriyanız tərəfindən istifadə edilən başqa bir üsulla təmizləyin.

Addım 3. Nümunəni şüşə slaydın üzərinə qoyun

Tibbi nümunədəki bakteriyaları və ya petri qabında böyüyən bakteriya mədəniyyətini təyin etmək üçün Gram boyama texnikasından istifadə edə bilərsiniz. Ən yaxşı nəticələr üçün nümunənin incə vuruşlarında Gram boyası istifadə edin. Yaşlı bakteriyaların hüceyrə divarlarını zədələmiş və Qram boyanmasına cavab verməyəcəyi üçün 24 saatdan az olan nümunələrdən istifadə etmək məsləhətdir.

Bir toxuma nümunəsi istifadə edirsinizsə, şüşə slaydına 1-2 damcı əlavə edin. Digər steril şüşə slaydın kənarından istifadə edərək sürüşdürərək nazik bir nümunə səpmək üçün slayd üzərində bərabər yayılır. Növbəti addımı atmadan əvvəl qurudun.
Bir petri qabından bakteriya alırsınızsa, aşılama döngəsini Bunsen ocağında parlayana qədər sterilizasiya edin, sonra soyumasına icazə verin. Slaydın üzərinə steril su damlatmaq üçün döngəni istifadə edin, sonra kiçik bir bakteriya nümunəsi toplamaq üçün istifadə etməzdən əvvəl sterilizasiya edin və yenidən sərinləyin. Bundan sonra yumşaq qarışdırın.
Bulyonda hazırlanan bakteriyalar bir vorteks istifadə edərək yenidən qarışdırılmalı, sonra su əlavə edilmədən yuxarıdakı kimi aşılama döngəsi ilə alınmalıdır.
Çubuq nümunəniz varsa (adətən kiçik pambıq uclu sapla aparılır), çubuğu sürüşmə üzərində toxunaraq yumşaq bir şəkildə döndərin.

Addım 4. Bir az yüksək temperatur yaxşı bir ləkə yarada bilər

İstilik bakteriyanı slaydın üstündə saxlayacaq, buna görə də boyanma prosesində asanlıqla həll olunmur. Bir Bunsen ocağının üzərinə iki -üç dəfə sürüşdürün və ya elektrikli bir qızdırıcının üzərinə sürüşdürün. Çox ısınmayın, nümunə zədələnə bilər. Bir Bunsen brülörü istifadə edirsinizsə, böyük bir narıncı alov yerinə kiçik, lakin mavi bir alov olmalıdır.

Alternativ olaraq, quru smeara 1-2 damcı metanol əlavə edərək, açıq havada buraxaraq slaydda qalan metanolu qurutmaqla metanol ilə də smear etmək olar. Bu texnika hüceyrə zədələnməsini minimuma endirir və təmiz bir slayd şəkli fonu təmin edir

Addım 5. Slaydı rəngləmə tepsisinin üzərinə yerləşdirin

Boyama qabları metaldan, şüşədən və ya üstü astarlı yumşaq meshli dayaz plastik lövhələrdən hazırlanır. Slaydları bu ağların üstünə qoyun ki, istifadə etdiyiniz maye tepsiyə axıdılsın.

Bir rəngləmə tepsisi yoxdursa, buz kublarını çap etmək üçün plastik bir tepsiyə bir slayd yerləşdirə bilərsiniz

Metod 2 /3: Qram Ləkə Prosesi

Addım 1. Ləkənin üzərinə kristal bənövşəyi maye tökün

Bir bakteriya nümunəsinə gentian bənövşə olaraq da bilinən bir neçə damcı kristal bənövşəyi boya ilə sprey etmək üçün bir pipet istifadə edin. 30-60 saniyə buraxın. Kristal bənövşəyi (KV) sulu məhlulda KV+ və xlorid (Cl-) ionlarına ayrılır. Bu ionlar həm qram-pozitiv, həm də qram-mənfi bakteriyaların hüceyrə divarlarına və hüceyrə membranlarına nüfuz edir. KV+ ionu, bakteriya hüceyrələrinin mənfi yüklü komponentləri ilə qarşılıqlı əlaqə quraraq hüceyrələrə bənövşəyi bir rəng verir.

Bir çox laboratoriyada çöküntünün qarşısını almaq üçün tərkibində ammonium oksalat olan "Hucker" kristal bənövşəyi istifadə olunur

Addım 2. Kristal bənövşəyi yumşaq bir şəkildə yuyun

Slaydı yatırın və kiçik bir distillə edilmiş və ya musluk suyunu slaydın üzərinə püskürtmək üçün bir yuyucu şüşə istifadə edin. Su ləkənin səthindən aşağı axmalı və birbaşa ləkəyə püskürtülməməlidir. Həddindən artıq yaxalamayın. Qram pozitiv bakteriyalardakı ləkələri aradan qaldıra bilər.

Addım 3. Ləkəni yod ilə yuyun, sonra durulayın

Yağı ləkələmək üçün bir damcı istifadə edin. Ən azı 60 saniyə saxlayın, sonra yuxarıdakı kimi diqqətlə yuyun. Yod mənfi yüklü ion şəklində KV+ ilə qarşılıqlı təsir edərək Kristal bənövşəyi ilə yod arasında böyük bir birləşmə kompleksi (CV-I mürəkkəb kompleksi) əmələ gətirir.) hüceyrənin daxili və xarici təbəqələrində. Bu birləşmələr kompleksi, ləkələnmiş yerlərdə hüceyrənin içərisində kristal bənövşənin bənövşəyi rəngini saxlayacaqdır.

Yod aşındırıcı bir maddədir. Nəfəs alma, udma və ya dəri ilə təmasdan çəkinin

Addım 4. Rəng ağartıcı əlavə edin, sonra tez yuyun

Diqqətlə vaxtlanmalı olan bu vacib addım üçün ümumiyyətlə 1: 1 nisbətində aseton və etanol qarışığı istifadə olunur. Slaydı müəyyən bir açıda yerləşdirin, sonra durulama üçün istifadə olunan suda bənövşəyi görünməyənə qədər rəng ağartıcısı əlavə edin. Ağartıcının tərkibində asetonun yüksək konsentrasiyası varsa, bu ümumiyyətlə 10 saniyədən az, hətta daha az vaxt aparır. Bu addımı dərhal dayandırın, əks halda boya qram pozitiv və mənfi hüceyrələrdən kristal bənövşəyi də çıxaracaq və boyanma prosesi təkrarlanmalıdır. Əvvəlki texnikadan istifadə edərək artıq rəngli ağartıcıları dərhal yuyun.

Təmiz aseton (95%+) əvəzedici olaraq istifadə edilə bilər. Nə qədər çox aseton istifadə etsəniz, ağartıcı daha sürətli işləyəcək, buna görə də vaxta daha çox diqqət yetirməlisiniz.
Bu addımın vaxtını izləməkdə çətinlik çəkirsinizsə, rəngli ağartıcı damla əlavə edin.

Addım 5. Qarşı boyanı ləkənin üzərinə səpin, sonra yuyun

Rəngsizləşdirilmiş (rəngsizləşdirilmiş) bakteriyalara, yəni qram-mənfi bakteriyalara çəhrayı və ya qırmızı rəng verərək qram-mənfi və qram-pozitiv bakteriyalar arasındakı kontrastı artırmaq üçün tez-tez safranin və ya fuçsin istifadə olunur. Ən azı 45 saniyə saxlayın. sonra durulayın.

Fuchsin, Haemophilus spp və Legionella spp kimi bir çox qram-mənfi bakteriyanı intensiv şəkildə ləkələyəcək. Bu üsul yeni başlayanlar üçün yaxşıdır

Addım 6. Slaydı qurudun

Onları açıq havada qurutmaq və ya bu məqsədlə satılan bibliya kağızından istifadə edərək qurutmaq olar.

Metod 3 /3: Boyama Nəticələrinin Yoxlanması

Addım 1. İşıq mikroskopunu hazırlayın

Slaydı mikroskopun altına qoyun. Bakteriyalar böyük ölçüdə dəyişirlər, buna görə tələb olunan ümumi böyütmə 400x ilə 1000x arasında dəyişəcək. Daha dəqiq bir görüntü üçün daldırma yağı olan obyektiv bir lens tövsiyə olunur. Baloncukların əmələ gəlməsini qarşısını almaq üçün damlama zamanı hərəkət etməmək üçün daldırma yağını slayd üzərinə atın. Obyektiv linzanın yerinə oturması və yağa toxunması üçün mikroskopun lens sapını hərəkət etdirin.

Yağ daldırma yalnız "quru" linzalarda deyil, xüsusi olaraq hazırlanmış linzalarda istifadə edilə bilər

Addım 2. Qram -müsbət və qram -mənfi bakteriyaları müəyyən etməyə çalışın

Slaydı işıq mikroskopu altında araşdırın. Qram-pozitiv bakteriyalar bənövşəyi rəngdə görünür, çünki kristal bənövşəyi qalın hüceyrə divarının içərisindədir. Qram-mənfi bakteriyalar çəhrayı və ya qırmızı rəngdə olacaq, çünki kristal bənövşəyi çəhrayı əks boyanın daxil olduğu nazik hüceyrə divarlarından yuyulur.

Nümunə çox qalın olarsa, nəticə yanlış pozitiv ola bilər. Nəticənin doğru olduğundan əmin olmaq üçün bütün qram pozitiv bakteriyaları göstərərsə yeni bir nümunə çəkin.
Çox rəngli ağartıcı istifadə etsəniz, nəticə yanlış mənfi ola bilər. Nəticənin düzgün olduğundan əmin olmaq üçün bütün qram -mənfi bakteriyaları göstərirsə yeni bir nümunə çəkin.

Addım 3. Gördüyünüz nəticələri istinad şəkli ilə müqayisə edin

Bakteriyaların necə göründüyünü bilmirsinizsə, ümumiyyətlə şəklinə və qram boyasına görə sıralanan istinad şəkilləri toplusunu araşdırın. [Milli Mikrobiyal Patojen Veritabanı, Fotoşəkillərdəki Bakteriyalar və digər bir çox onlayn saytlarda da onlayn məlumat bazalarına baxa bilərsiniz. Tanıma işini asanlaşdırmaq üçün aşağıda, qram vəziyyətinə və formasına görə təsnif edilən, tez -tez rast gəlinən və ya əhəmiyyətli olan bakteriyaların nümunələri verilmişdir.

Addım 4. Formasına görə qram pozitiv bakteriyaları müəyyənləşdirin

Bakteriyalar mikroskop altında şəkillərinə görə daha çox təsnif edilirlər, ən çox kokklar (sferik) və ya çubuqlar (silindrik). Formasına görə qram-pozitiv bakteriyaların (bənövşəyi rəngli) bəzi nümunələri:

Qram pozitiv koklar adətən stafilokokklar (qrup kokları deməkdir) və ya streptokoklar (zəncirvari koklar deməkdir).
Bacillus, Clostridium, Corynebacterium və Listeria kimi qram pozitiv çubuqlar. Çubuq bakteriyaları Actinomyces spp. ümumiyyətlə filial və ya filamentlərə malikdir.

Addım 5. Qram -mənfi bakteriyaları müəyyənləşdirin

Qram-mənfi bakteriyalar (çəhrayı rəngli) tez-tez üç qrupa bölünür. Koklar sferik formadadır, çubuqlar uzun və nazikdir, aralarında kokkod çubuqlar vardır.

Qram mənfi koklar Ən çox yayılmış Neisseria spp növüdür.
Qram-mənfi çubuqlar məsələn E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas və bir çoxları. Vibrio kolera normal bir kök və ya əyilmiş bir kök olaraq görülə bilər.
Qram-mənfi "coccoid" (və ya "coccobacilli") çubuq bakteriyaları məsələn Bordetella, Brucella, Haemophilus və Pasteurella

Addım 6. Nəticələrin qarışıq olub olmadığını diqqətlə yoxlayın

Bəzi bakteriyaların hüceyrə divarlarının kövrəkliyi və ya mumlu olması səbəbindən dəqiq rəng vermək çətindir. Bu bakteriyalar eyni hüceyrədə və ya eyni smearda fərqli hüceyrələr arasında bənövşəyi və ya çəhrayı bir qarışıq göstərə bilər. 24 saatdan çox olan bakteriya nümunələri bu problemi göstərə bilər, lakin hər hansı bir seçmə yaşında rənglənməsi çətin olan bəzi bakteriya növləri də var. Bu bakteriyalar, turşuya sürətli boyanma, bakteriya mədəniyyətində müşahidə, TSI mədəniyyət mühitləri və ya genetik testlər kimi daha çox xüsusi testlər tələb edir.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium və Propionibacterium spp. hamısı qram-pozitiv bakteriyalardır, lakin çox vaxt aydın şəkildə boyanmır.
Treponema, Chlamydia və Rickettsia spp kimi kiçik, incə bakteriyalar. qram üsulu ilə ləkələmək çətindir.

Addım 7. Qalan istehlak materiallarını və avadanlıqları atın

Bu tullantıların atılması proseduru laboratoriyalar arasında dəyişir və istifadə olunan materiallardan asılıdır. Tipik olaraq, boyama qabındakı maye təhlükəli tullantılar etiketli şüşələrə atılır. Slaydları 10% ağartma məhlulu ilə isladın, sonra iti bir qaba atın.

İpuçları

Unutmayın ki, qram boyanma nəticələri yalnız nümunə yaxşı olarsa yaxşı olacaq. Yaxşı bir nümunə təmin edə bilmələri üçün xəstələrə məlumat vermək vacibdir (məsələn, balgam nümunəsi əldə etmək üçün tüpürməklə dərin öskürək arasındakı fərq).
Bir rəng ağartıcısı olaraq, etanol asetona nisbətən daha yavaş reaksiya verir.
Təhlükəsizliyi təmin etmək üçün standart laboratoriya qaydalarına riayət edin.
Təcrübə üçün yanaq çubuğu istifadə edin, çünki tərkibində həm qram-müsbət, həm də qram-mənfi bakteriyalar var. Yalnız bir növ bakteriya görürsünüzsə, çox az və ya çox ağartıcı istifadə edə bilərsiniz.
Sürüşməni təmin etmək üçün taxta qıfıllardan istifadə edə bilərsiniz.

Xəbərdarlıq

Aseton və etanol yanan maddələrdir. Aseton əllərinizdəki yağı çıxaracaq və dərinizin digər kimyəvi maddələri mənimsəməsini asanlaşdıracaq. Əlcək geyin və ehtiyatla istifadə edin.
Gram ləkəsini və ya əks ləkəni yaxalamadan əvvəl ləkənin qurumasına icazə verməyin.